Ny upptäckt av bakterieforskare kan underlätta modifiering av gener

De nya resultaten presenteras av forskare vid Umeå universitet, University of California, Berkeley, USA, och Max F. Perutz Laboratories vid universitetet i Wien, Österrike. Det internationella forskarlaget har identifierat mekanismen för en komponent i det bakteriella immunsystemet. Mekanismen kan lätt anpassas för olika tillämpningar inom genforskningen. Studien publiceras online den 28 juni i tidskriften Science.

Verktyg som kan klyva DNA-strängar vid exakt definierade ställen är avgörande för att studera och förändra en organisms genuppsättning i laboratoriestudier. I nuläget behöver forskare hitta eller syntetisera proteiner som känner igen den specifika DNA sekvensen, fäster till den och klyver den, en tidskrävande och mödosam process.
– Men det kan nu ändras, säger Emmanuelle Charpentier, gruppledare vid Laboratoriet för molekylär infektionsmedicin MIMS, vid Umeå universitet.

Styr enzym
Forskarna har hittat ett RNA-baserat molekylkomplex som används av bakterier för att styra enzymet Cas9 till en specifik plats i en främmande gen hos virus eller i DNA som kommer från andra bakterier. Enzymet kan sedan klippa sönder genen. Komplexet identifierades av Emmanuelle Charpentiers forskargrupp tillsammans med kollegor i Jennifer Doudnas forskargrupp vid Howard Hughes Medical Institute i Berkeley, USA. Resultatet blev ett system som lätt kan programmeras till att styra Cas9-proteinet till att klyva specifika dubbelsträngade DNA-sekvenser.

– Vi kan styra proteinet till den del av DNA-strängen som vi önskar, säger Emmanuelle Charpentier.
– Det styrande RNA-komplexet innehåller både den struktur som krävs för Cas9 att binda vid DNA och en separat sekvens av RNA som kan para sig med DNA. Därför kan vi programmera Cas9 för en specifik DNA-sekvens genom att helt enkelt ändra styrsekvensen i RNA. Detta system erbjuder ett enkelt sätt att klyva varje önskad plats i genomet i en cell. Det skulle därför kunna användas för att införa ny genetisk information i en metod kombinerad med välkända cellulära mekanismer för DNA-rekombination som kan koppla samman DNA-molekyler.

Mikrobiologen Emmanuelle Charpentier är intresserad av de molekylära mekanismer som RNA använder för att påverka genuttryck. Upptäckten som nu presenteras är resultatet av ett samarbete som etablerades förra året med Jennifer Doudna vid Howard Hughes Medical Institute (HHMI) vid University of California, Berkeley, USA. Båda forskargrupperna studerar olika aspekter av RNA-baserade försvarsmekanismer i bakterier som känner igen och förstör inkräktande DNA, virus och plasmider.

Del av bakteriens immunförsvar
Så sent som under 1980-talet rapporterades för första gången om ett system som kallas CRISPR, som står för Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. CRISPR är en del av bakteriernas immunsvar på en virusinfektion eller plasmidintrång, där korta bitar av inkräktarens DNA – proto-spacer – integreras i värdorganismens kromosom. Dessa sekvenser transkriberas och bearbetas för att bilda korta crRNA, som framöver kan känna igen främmande DNA och vidhäfta till den. Till följd av vidhäftningen kan proteinet Cas (CRISPR-associerat) binda till crRNA-DNA-komplexet för att klyva DNA-molekylen och inaktivera den.

Tidigare studier av CRISPR-systemet i olika bakterier visade i de flesta fall att crRNA förenas med ett stort multiprotein-komplex för att attackera virus och plasmider. Däremot har Charpentiers forskargrupp tidigare upptäckt att humanpatogena Streptococcus pyogenes crRNA bara kunde bildas vid närvaro av en annan RNA, tracrRNA (trans-activating crRNA). Forskarna publicerade sin upptäckt förra året i tidskriften NATURE (Nature, 2011, 471 (7340): 602 -607).
Vidare behöver CRISPR i S. pyogenes och relaterade system bara ett enda protein, Cas9, för att immunförsvar med crRNA mot virus ska kunna byggas upp.

Kopplade ihop molekylerna
Charpentiers och Doudnas forskargrupper undersökte tillsammans de molekylära mekanismer som låg bakom Cas9 och crRNAs funktion i det bakteriella immunförsvaret. Martin Jinek, forskare vid HHMI, lyckades med att isolera Cas9-proteinet i ren form. Emmanuelle Charpentiers doktorand Krzysztof Chylinski, som forskar vid MIMS och vid Max F Perutz Laboratories i Wien, Österrike, fortsatte studera proteinet. Krzysztofs studier visade att Cas9 behövde både crRNA och tracrRNA för hitta vägen och genomföra sin attack mot främmande DNA.

– Vi beslutade då att pröva om vi kan koppla ihop dessa två RNA-molekyler till en enda, chimär RNA-molekyl, förklarar Emmanuelle Charpentiers. På det sättet skulle systemet vara enklare att använda som verktyg i laboratorier.
Det fungerade. Resultatet blev ett DNA-klyvningsenzym som kan programmeras med en enda RNA-molekyl för att hitta och klyva specifika DNA-sekvenser.
– Nästa steg, säger Emmanuelle Charpentier, är att testa det nya RNA-komplexet tillsammans med Cas9 i eukaryota organismer som rundmaskar, växter och humana celler för att ta reda på om det RNA-programmerade enzymet också fungerar i eukaryota organismer.

Om forskarna i Umeå och Kalifornien lyckas med det så kan det bli många praktiska tillämpningar av det nya genverktyget – från insatser inom biotekniken till teknisk biobränsleproduktion baserad på mikroorganismer vidare till cellbaserade medicinska tillämpningar.
– Det kommer att bli ett mycket viktigt verktyg som gör det möjligt att på ett enkelt och billigt sätt att förändra gener i laboratoriet, säger Emmanuelle Charpentier.

INFORMATION OCH KONTAKT
För mer information, kontakta gärna:
Dr Emmanuelle Charpentier, MIMS, Umeå universitet:
E-post: emmanuelle.charpentier@mims.umu.se
http://www.mims.umu.se/en/groups/emmanuelle-charpentier.html

Jennifer A Doudna, professor och Howard Hughes Medical Institute Investigator
Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley
E-post: doudna@berkeley.edu

Originalpublikation:
Jinek M *, Chylinski K *, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA and Charpentier E. A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science (2012) (28 juni, ahead of print). *Equal contribution

Arbetet finansierades med stöd från det svenska Vetenskapsrådet, Kempestiftelserna, Umeå universitet, österrikiska Science Fund (Doktoratsprogram i RNA-biologi), universitetet i Wien, och Howard Hughes Medical Institute.

The Laboratory for Molecular Infection Medicine Sweden (MIMS) är den svenska noden i det nordiska EMBL partnerskapet för molekylär medicin.